Optimización del proceso de extracción de compuestos fenólicos de la angiosperma marina Thalassia testudinum / Optimization of the extraction process of phenolic compounds from the marine angiosperm Thalassia testudinum

RESUMEN Thalassia testudinum es la planta marina de mayor abundancia en el litoral de La Habana y del Caribe en general, conocida comúnmente como praderas submarinas o hierba de tortuga. Entre los compuestos de interés que se pueden encontrar en esta especie sobresalen los polifenoles, los cuales son componentes estructurales de su pared celular y poseen propiedades funcionales y bioactivas como antioxidante, anti-inflamatorio, neuroprotector y hepatoprotector. Investigaciones previas evaluaron diversos métodos de extracción de compuestos bioactivos para esta especie, por lo que este trabajo tuvo como objetivo optimizar las condiciones de extracción del contenido de polifenoles totales. Para ello se utilizó el método de Box y Hunter y se evaluó el efecto de tres factores influyentes en la extracción de compuestos fenólicos (velocidad de agitación, relación material vegetal/% alcohol y concentración de etanol). Como variable respuesta se empleó el contenido de polifenoles totales determinada por el método de Folin-Ciocalteu. Los resultados del diseño proporcionaron como condiciones óptimas en las variables estudiadas las siguientes: 1/11.5 p:v, 60% de EtOH y 800 r.p.m., alcanzando rendimiento de polifenoles totales, igual a 25.60 mg/g de extracto seco; superior a las restantes condiciones de extracción para un extracto bioactivo con potencialidades de uso en la industria farmacéutica o nutracéutica.

ABSTRACT Thalassia testudinum is the marine plant of greatest abundance along the coast of Havana and the Caribbean in general, commonly known as seagrass meadows or turtle grass. Among the compounds of interest that can be found in this species there are polyphenols, which are structural components of its cell wall and have functional and bioactive properties such as antioxidant, anti-inflammatory, neuroprotective and hepatoprotective. Previous research evaluated different methods of extracting bioactive compounds from this species, and this work aimed to optimize the extraction conditions of the total polyphenol content. For this, the Box and Hunter method was used and the effect of three influential factors in the extraction of phenolic compounds (agitation speed, vegetal material / solvent ratio and ethanol concentration) was evaluated. The total polyphenol content determined by the Folin-Ciocalteu method was used as a response variable. The design results provided as optimal conditions in the studied variables the following: 1/11.5 w: v, 60% EtOH and 800 r.p.m., reaching a total polyphenol yield of 25.60 mg/g of dry extract; which contributes to the obtaining of a better content of total phenols in a bioactive extract with potentialities of use in the pharmaceutical or nutraceutical industries.

Seasonal behavior of Thalassia testudinum (Hydrocharitaceae) metabolites / Comportamiento estacional de los metabolitos de Thalassia testudinum (Hydrocharital: Hydrocharitaceae)

Abstract:The marine angiosperm Thalassia testudinum, commonly known as turtle grass, is a dominant sea- grass that grows in the Caribbean Sea shelf associated to Syringodium filiforme. The hydroalcoholic extract of T. testudinum is rich in polyphenols; the most abundant metabolite in this extract is thalassiolin B, a glycosilated flavonoid with skin damage repairing properties, and antioxidant capacity among others. The present study aimed at generating information about the seasonal behavior of secondary metabolites, as well as to study the antioxidant capacity of the T. testudinum leaves extract, collected monthly during 2012 from the Northeast coastline of Havana, Cuba. For this study, spectrophotometric methods were used to determine the concentrations of polyphenols, flavonoids, anthocyanins, soluble carbohydrates and proteins, chlorophylls a and b, and antioxidant activity of the extracts. In general, results demonstrated seasonal variations of the analyzed parameters. Extracts prepared from the vegetal material collected in October and November showed the highest values of polyphenols (58.81 ± 1.53 and 52.39 ± 0.63 mg/g bs, respectivally) and flavonoids (44.12 ± 1.30 and 51.30 ± 0.67 mg/g dw, respectively). On the contrary, the lowest values of polyphenols were found in extracts of leaves collected in July and August (15.51 ± 0.84 and 13.86 ± 0.48 mg/g, respectively). In accordance with these results, the lower value of Inhibitory Concentration (IC50) was obtained to get a 50 % of maximal effect on free radical scavenging activity with the extracts prepared from leaves collected in October and November, and less significant IC50 was obtained from the extract prepared from leaves collected in August (5.63 mg/mL). A negative correlation (r= -0.694) was observed in this study between the content of polyphenols and the IC50 necessary to get the half of its antioxidant maximal effect. The high correspondence between the maximum values of polyphenols, flavonoids, carbohydrates and proteins in October and November, revealed a close relationship between these metabolites found in the extract of T. testudinum. Our hypothesis about the annual variation in the concentration of these metabolites was validated; and these results will support the correct harvesting of T. testudinum leaves for biotechnology and industrial purposes. Rev. Biol. Trop. 64 (4): 1527-1535. Epub 2016 December 01.

Resumen:La angiosperma marina Thalassia testudinum, comúnmente conocida como "hierba tortuga", es un pasto marino dominante que crece en el Mar Caribe asociada a Syringodium filiforme. El extracto hidroalcohólico de T. testudinum es rico en polifenoles; el metabolito más abundante en este extracto es thalassiolina B, un flavonoide glicosilado con propiedades para la reparación de daños en la piel y la capacidad antioxidante, entre otros. El objetivo del presente estudio fue conocer el comportamiento estacional de los metabolitos secundarios, así como la capacidad antioxidante del extracto de hojas de T. testudinum recolectadas mensualmente durante el 2012, en la costa noreste de La Habana, Cuba. Para este estudio fueron empleados métodos espectrofotométricos para la determinación de la concentración de polifenoles, flavonoides, carbohidratos y proteínas solubles, clorofilas a y b y la actividad antioxidante del extracto. En sentido general, los resultados demostraron las variaciones estacionales de los parámetros analizados; los extractos preparados a partir de material vegetal recolectado en octubre y noviembre mostraron los mayores valores de polifenoles y flavonoides (44.12 ± 1.30 y 51.30 ± 0.67 mg/g bs respectivamente) y se encontraron los valores más bajos en los extractos de hojas recolectadas en julio y agosto. (15.51 ± 0.84 y 13.86 ± 0.48 mg/g respectivamente). De acuerdo con los resultados, se obtuvo el valor más bajo de la concentración inhibitoria (CI50 ) necesaria para obtener un 50 % de efecto máximo en la actividad de captación de radicales libres con los extractos preparados a partir de las hojas recolectadas en octubre y noviembre y la CI50 menos significativa se obtuvo a partir del extracto preparado a partir de las hojas recolectadas en agosto (5.63 mg/ml). Se observó una correlación negativa (r= -0,694) entre el contenido de polifenoles y la CI50 necesaria para obtener la mitad del efecto antioxidante máximo. La alta correspondencia que existe entre los valores máximos de polifenoles, flavonoides, carbohidratos y proteínas en octubre y noviembre reveló una estrecha relación entre estos metabolitos, encontrados en el extracto de T. testudinum. La hipótesis de la variación anual de la concentración de estos metabolitos fue validada. Estos resultados se tendrán en cuenta con el fin de seleccionar el momento de recolecta de las hojas de T. testudinum para su uso con fines biotecnológicos e industriales.

Evaluación preliminar de la actividad antiviral del extracto de Laurencia obtusa frente a herpesvirus y virus dengue / Preliminary evaluation of the antiviral activity of Laurencia obtuse extract against herpesvirus and dengue virus

Introducción: los virus del herpes simplex y el virus dengue se encuentran entre los patógenos humanos de mayor importancia dados los altos niveles de morbilidad y mortalidad que provocan. El fallo en el desarrollo de vacunas para ambos virus, así como la ausencia de fármacos para el tratamiento del dengue y el surgimiento de nuevas variantes virales resistentes a las drogas existentes para los herpesvirus, incrementa la necesidad de buscar nuevas fuentes de compuestos con actividad antiviral. En este sentido las algas son una alternativa interesante debido a la diversidad de compuestos con actividad biológica que se han aislado de estos organismos. Objetivo: evaluar la actividad antiviral in vitro de un extracto hidroalcohólico del alga roja Laurencia obtusa frente a virus herpes simplex tipo1, herpes simplex tipo 2 y virus dengue. Métodos: se determinó el valor de concentración citotóxica media empleando el ensayo de reducción de MTT en células Vero y C6/36HT. El cálculo de la concentración efectiva media se realizó mediante inhibición del efecto citopático en células Vero o C6/36HT, dependiendo del virus. El índice selectivo se calculó a partir de la relación IS=CC50/CE50. Resultados: el extracto hidroalcohólico de L obtusa no es tóxico en las células Vero y C6/36HT, en el rango de concentraciones evaluadas. El extracto inhibió la replicación in vitro de los virus HHV 1 y HHV 2 en células Vero con valores de IS>29 y 42, respectivamente. Por otra parte no se observó inhibición de la replicación de DENV-2 en células C6/36HT. Conclusiones: el extracto hidroalcohólico de L. obtusa posee actividad antiviral frente a HHV 1 y HHV 2 pudiera ser empleado en el desarrollo de fármacos antiherpéticos novedosos. Este trabajo constituye el primer informe sobre la actividad antiviral de esta especie de alga(AU)

Introduction: herpes simplex and dengue viruses are the most important human pathogens with high levels of morbidity and mortality. Lack of vaccine development for these viruses, non-existence of drugs for dengue treatment and the emergence of new herpes virus variants resistant to drugs currently in use reinforce the need for new sources of antiviral drugs. Algae remain an interesting alternative in this regard, due to the diversity of compounds with biological activity found in these organisms. Objective: to evaluate the in vitro antiviral activity of a hydroalcoholic extract of the red seaweed Laurencia obtusa against herpes simplex type 1, herpes simplex type 2 and dengue virus. Methods: the mean cytotoxic concentration was determined by using the MTT reduction assay in Vero and C6/36HT cells. Mean effective concentration was estimated with the cytopathic effect inhibition in Vero or C6/36HT cells depending on the virus. Selective index (SI) =CC50/EC50 was calculated. Results: hydroalcoholic extract from L.obtusa was not toxic at the evaluated concentrations The extract managed to inhibit HHV 1 y HHV 2 virus replication in Vero cells with SI values higher than 29 and 42, respectively. On the other hand there was no inhibition of DENV-2 replication in C6/36HT cells. Conclusions: hydroalcoholic extract from L. obtusa showed in vitro antiviral activity against HHV 1 and HHV 2 and could be employed as a source for new antiviral compounds. This is the first report on the antiviral activity of this alga species(AU)

Actividad antiviral in vitro de un extracto acuoso del alga roja Tricleocarpa fragilis frente a virus influenza A / In vitro antiviral activity of aqueous extract from red seaweed Tricleocarpa fragilis to Influenza A virus

INTRODUCCIÓN: los virus influenza constituyen importantes patógenos de humanos que anualmente causan alrededor de 500 000 muertes a nivel mundial. La emergencia de variantes virales resistentes a los fármacos antiinfluenza disponibles, motiva la búsqueda de nuevos antivirales. Los extractos obtenidos a partir de algas pueden ser empleados con esta finalidad, teniendo en cuenta la diversidad de metabolitos secundarios descritos en estos organismos. OBJETIVO: evaluar la actividad antiviral in vitro de un extracto acuoso del alga roja Tricleocarpa fragilis frente a virus influenza A(H1N1) y A(H3N2) MÉTODOS: se determinó el valor de concentración citotóxica media (CC50) empleando el ensayo de reducción de MTT en células MDCK . El cálculo de la concentración inhibitoria media (CI50) se realizó mediante un ensayo de hemaglutinación y de inhibición del efecto citopático (ECP) en células MDCK. El índice selectivo (IS) se calculó a partir de la relación IS= CC 50/CI50. RESULTADOS: el extracto acuoso de T. fragilis no resultó tóxico en las células MDCK, en el rango de concentraciones evaluadas. El alga inhibió la replicación in vitro de virus influenza A(H1N1), A(H3N2) con valores de IS> 11,4 y 106, respectivamente. CONCLUSIONES: el extracto acuoso de T. fragilis posee actividad antiviral frente a virus influenza A y puede ser empleado en el desarrollo de fármacos antiinfluenza novedosos. Este trabajo constituye el primer informe sobre la actividad antiviral de esta especie de alga(AU)

INTRODUCTION: influenza viruses are major human pathogens that cause over 500 000 deaths every year. The emergence of viral variants resistant to approved antiviral drugs has prompted the search for new anti-influenza compounds. Alga could be used as a source for the development of new anti-influenza drugs, taking into account the diversity of secondary metabolites previously described in these organisms. OBJECTIVE: to evaluate the in vitro antiviral activity of aqueous extract of the red seaweed Tricleocarpa fragilisagainst influenza A virus. METHODS: the mean citotoxicity (CC50) concentration of the extract was determined by using the MTT reduction assay in MDCK cells. The mean inhibitory concentration (CI50) was estimated by means of viral protein (hemagglutinin) test and a cytopathic effect inhibition test in MDCK cells. The Selective index was calculated from (SI)= CC50/IC50. RESULTS: T. fragilis was not toxic at the concentrations evaluated in MDCK cells. The aqueous extract inhibited in vitro influenza A(H1N1) and A(H3N2) virus replication with SI values > 11.4 and 106; respectively. CONCLUSIONS: aqueous extract of T. fragilis showed in vitro anti-influenza activity and can be employed as a source for new antiviral drugs. This paper was the first report for the antiviral activity of T. fragilis(AU)

Actividad antiplasmodial in vivo de las esponjas Mycale laxissima y Clathria echinata / In vivo antiplasmodial activity of Mycale laxissima and Clathria echinata sponges

Introducción: la búsqueda de nuevas sustancias antimaláricas incluye entre sus retos el desarrollo de alternativas para el tratamiento de la malaria cerebral, debido a la alta mortalidad y las deficiencias neurológicas persistentes después del tratamiento con los medicamentos recomendados actualmente. Objetivos: evaluar la actividad de fracciones orgánicas de Mycale laxissima y Clathria echinata en el modelo de malaria cerebral producida por la infección de ratones C57BL/6 con Plasmodium berghei ANKA. Métodos: se evaluaron fracciones orgánicas obtenidas mediante cromatografía flash en fase inversa a partir de los extractos crudos de las dos especies. Se realizó un análisis químico cualitativo para detectar la presencia de saponinas, triterpenos/esteroides y alcaloides en estas fracciones. El efecto esquizonticida de las fracciones se determinó mediante la prueba de supresión de la parasitemia al inicio de la infección. Se evaluaron la supervivencia, los síntomas neurológicos y la reducción del peso corporal en los días subsiguientes. Resultados: las fracciones orgánicas de Mycale laxissima a dosis de 200 mg/kg y Clathria echinata a100 mg/kg no mostraron una disminución sustancial del peso de los animales o muertes hasta el día 4; para las cuales se obtuvieron reducciones significativas de las medianas de la parasitemia de 45 % y 53 %, respectivamente. La fracción de Mycale laxissima a 200 mg/kg produjo un incremento significativo en el tiempo de supervivencia hasta 20 d, mientras los animales tratados con Clathria echinata a 100 mg/kg presentaron una mediana de tiempo de supervivencia de 16 d. Ambos incrementos fueron superiores a 7 d. En este período, los animales tratados con las fracciones orgánicas de Clathria echinata y Mycale laxissima no presentaron los síntomas neurológicos observados en los controles. Esta prolongación de la supervivencia fue similar a la observada en presencia de dosis de 7,5 mg/kg de cloroquina. Conclusiones: las fracciones orgánicas de Mycale laxissima y Clathria echinata mostraron actividades antimaláricas, promisorias en el modelo de infección de ratones C57BL/6 con Plasmodium berghei ANKA, que sugieren el estudio de sus constituyentes químicos activos.

Introduction: the search of new antimalarial compounds comprises, among its challenges, the development of therapeutic alternatives for cerebral malaria; due to the high mortality and neurological deficiencies that persist after treatment with recommended drugs. Objectives: to evaluate the activity of organic fractions of Mycale laxissima and Clathria echinata in the cerebral malaria model of infection of C57BL/6 mice with Plasmodium berghei ANKA. Methods: preparative fractions of both species were obtained by reverse-phase flash chromatography. In order to detect the presence of saponins, triterpenods/steroids and alkaloids, a qualitative chemical analysis was performed. The schyzontocidal effect of the extracts was determined by the suppression test at the beginning of the infection. Survival, neurological symptoms and body weight changes were evaluated in subsequent days. Results: the organic fractions of Mycale laxissima at 200 mg/kg and Clathria echinata at 100 mg/kg showed neither substantial reductions of body weights, nor deaths of animals until day 4; but caused significant reductions of median parasitemia of 45 % and 53 % respectively. The fraction of Mycale laxissima at 200 mg/kg caused a significant increase in the median survival time up to day 20, whereas animals treated with Clathria echinata at 100 mg/kg presented a survival of 16 days. Both increases the survival time 7 days. Neurological alterations were not observed in the groups treated with organic fractions when compared to the control group. This survival extension was similar to the effect of administration of 7.5 mg/kg of chloroquine. Conclusions: the organic fractions of Mycale laxissima and Clathria echinata exhibited promising antimalarial activities in the infection model of C57BL/6 mice with Plasmodium berghei ANKA. This indicates that their active chemical constituents should be studied.

Efecto antioxidante y contenido polifenólico de Syringodium filiforme (Cymodoceaceae)

Antioxidant effect and polyphenol content of Syringodium filiforme (Cymodoceaceae). The marine phanerogam Syringodium filiforme, known as "manatee grass", is a common species that grows in coastal areas associated to Thalassia testudinum. With the aim to describe some of its possible chemical characteristics, this study was performed with a sample of 1.2kg, collected in March 2009, in Guanabo beach, Havana, Cuba. The sample was dried (less than 12% humidity) and a total extract prepared; other three extracts were prepared with the use of solvents of increasing polarity. The phytochemical screening and analytical determinations of each fraction were undertaken Total polyphenol content was determined using pyrogallol as reference´s standard; chlorophyll a and b and anthocyanin content were also quantified. Total extract and fractions antioxidant activity were evaluated by using the free radical scavenging activity assay with 1,1- Diphenyl-2-Picrylhydrazyl reactive (knowing as DPPH´s method). The phytochemical screening of the different extracts detected the presence of high concentrations of flavonoids, phenols, terpenes, antocyaninns, reducing sugars and alkaloids. The total extract and methanol fraction showed significant free radical scavenging properties, while the petroleum ether fraction showed moderate activity, and the chloroform fraction and the aqueous soluble precipitate (residual salt) obtained didn’t show antioxidant properties against free radicals. The results of this work confirmed the potentialities of this species for biological purposes. Rev. Biol. Trop. 59 (1): 465-472. Epub 2011 March 01.

La fanerógama marina Syringodium filiforme, conocida comúnmente como "Hierba Manatí", crece en los fondos marinos tropicales asociada con la especie Thalassia testudinum. Este estudio fue realizado con una muestra de S. filiforme (1.2kg peso húmedo) recolectada en la playa de Guanabo en La Habana, Cuba en Marzo 2009. La muestra fue secada hasta humedad inferior al 12% y se realizaron tres extracciones con solventes de polaridad creciente previamente al tamizaje fitoquímico y a las determinaciones analíticas. A partir del extracto total y en las fracciones se detectó la presencia de grupos químicos, fundamentalmente estructuras típicas de los flavonoides, por las absorbancias obtenidas en los espectros ultravioleta-visible. En el tamizaje fitoquímico se corroboró la existencia de altas concentraciones de flavonoides, triterpenos, polifenoles, antocianinas, azúcares reductores y alcaloides en los diferentes extractos obtenidos. El contenido de polifenoles totales de S. filiforme, se cuantificó mediante el uso de pirogalol como patrón de referencia; así como el contenido de clorofilas a y b, y el nivel de antocianinas. La actividad antioxidante se determinó por el método reducción del 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). El extracto total y la fracción metanólica mostraron elevada actividad antioxidante en correspondencia con la concentración de polifenoles, mientras que la fracción de éter de petróleo mostró actividad moderada y la fracción clorofórmica y el precipitado remanente no muestran actividad antioxidante significativa. Estos resultados predicen las potencialidades de la especie para su uso con fines biológicos.

Evaluación de la actividad de extractos marinos sobre Plasmodium falciparum in vitro y aspártico proteasas / Evaluation of the marine extracts action on Plasmodium falciparum in vitro and on aspartic proteases

Introducción: la búsqueda de nuevas drogas o alternativas terapéuticas para el tratamiento de la malaria es una alta prioridad en la lucha por el control de esta enfermedad. En la actualidad, varios estudios se concentran en la evaluación de inhibidores de proteasas de tipo aspártico presentes en la vacuola digestiva de Plasmodium falciparum, las cuales son parte de las enzimas que participan en la degradación de la hemoglobina. Los escasos reportes en la literatura sobre la purificación de inhibidores de proteasas aspárticas a partir de organismos marinos sugieren que constituyen una fuente de este tipo de moléculas prácticamente inexplorada. Métodos: las especies de invertebrados marinos Phallusia nigra, Bugula sp., Lyssodendoryx isodictyalis, Ascidia sydneiensis, Microscosmus goanus, Holothuria mexicana, Lytechinus variegatus y Echinaster sp. fueron colectadas en la localidad de Puerto Esperanza, Pinar del Río, en abril de 2006 y se prepararon extractos etanólicos. Se realizó la evaluación antimalárica in vitro contra Plasmodium falciparum de estos extractos con valores descriptivos de eficacia comparables a los utilizados internacionalmente. Los resultados se relacionaron con los hallazgos de los ensayos de inhibición de la actividad enzimática de pepsina como modelo de proteasa aspártica y con el perfil químico de metabolitos secundarios en estos extractos. Resultados: se encontró una buena reproducibilidad de la actividad antimalárica de los extractos de P. nigra, M. goanus y L. isodictyalis con concentraciones inhibitorias medias menores que 50 µg/mL. El extracto de M. goanus mostró la posible presencia de un inhibidor de pepsina. El perfil químico obtenido para las ascidias se corresponde con los principales compuestos reportados para las familias Pyuridae y Ascidiidae. La actividad antimalárica, así como la actividad inhibidora de pepsina, pudiera ser atribuida a algunos de los grupos de metabolitos secundarios detectados...

Background: the search for new drugs or therapeutic alternatives for malaria treatment is a high priority in the struggle against this disease. At present, several studies are focused on the evaluation of aspartic protease inhibitors present in the digestive vacuole of Plasmodium falciparum, which are part of the enzymes involved in hemoglobin degradation. The few reports in literature on the purification of aspartic proteases inhibitors from marine organisms suggest that they are a practically unexplored source of this type of molecules. Methods: marine invertebrate species Phallusia nigra, Bugula sp., Lyssodendoryx isodictyalis, Ascidia sydneiensis, Microscosmus goanus, Holothuria mexicana, Lytechinus variegatus y Echinaster sp.were detected in Puerto Esperanza area, Pinar del Rio province, on April 2006 and then ethanol extracts were prepared. In vitro antimalarial evaluation of these extracts against Plasmodium falciparum, with descriptive efficacy values being comparable with those used worldwide. The results were associated to the findings of aspartic protease model-like pepsin enzymatic action inhibition tests and to the chemical profile of secondary metabolites in these extracts. RESULTS: good reproducibility of antimalarial action of P. nigra, M. goanus y L. isodictyalis extracts was found, being the average inhibitory concentrations lower than 50 µg/mL. M. goanus extract showed a possible pepsin inhibitor. The chemical profile for ascidians corresponded to the main compounds reported in Pyuridae y Ascidiidae families. The antimalarial activity as well as the pepsin inhibitory activity might be attributed to some of the detected secondary metabolites. Conclusions: the breaking-up of these extracts is recommended in order to isolate the chemical compounds involved in the studied biological activities.